滨松中国
应用领域

全内反射荧光成像(TIRF)

虽然宽场荧光显微镜有着极其广泛的应用,并在针对培养细胞的in vitro(离体)成像实验中成为标配,但其本质的缺点在于在Z方向上没有分辨率,所有焦平面内外的荧光分子都在宽场荧光成像中都会被激发,使得采用面阵相机所拍出的图像会受到焦平面外信号非常大的影响,既降低了信噪比,也使三维的成像无法呈现。为了克服这个缺点,市场中已经有许多方法来使成像得到Z方向的分辨率,这些方法可分为两类,一类为只收集焦平面的信息,如激光扫描共聚焦和转盘共聚焦;另一类为只激发焦平面的荧光探针,如双光子共聚焦、lightsheetTIRF等技术。

其中TIRF采用的原理是当激发光在发生全反射时,仅能形成倏逝波点亮界面另一侧100-200nm深度内的荧光探针分子。因为倏逝波的能量随着离界面的距离的增大而呈指数下降,所以荧光信号被严格限定于全反射界面(一般是承载样品的玻片与样品之间的界面)附近。

由于TIRF实验中仅仅激发了100-200nm范围内的荧光分子,其信号的强度是比较弱的;所以推荐使用EMCCD和高端的sCMOS进行TIRF成像应用。

应用实例

荧光小球在表面布朗运动

在玻璃表面接上DNA1-3 kbp,接avidin;另取biotin修饰的聚乙二醇铺玻璃表面),然后DNA的另一端接个200nm荧光小球。这种结构下荧光小球的布朗运动是可以被观察到的。而当核小体在这个DNA上形成时,DNA双链会缠绕组蛋白,使得其布朗运动被控制到更小的范围内。此体系可以用来研究各个因素对于核小体形成的影响。TIRF用来剔除表面外的荧光信号,提升信噪比。

 
 

样品:200nm荧光小球

方法:TIRF

用户:北京大学生物动态成像中心

相机:Hamamatsu Flash 4.0

软件:HCimage/NIS Elements 4.0

显微镜:Nikon Ti-E

高帧速与高分辨率保证了Flash 4.0对于荧光样品运动轨迹的还原。而极大地芯片尺寸也使得Flash 4.0能够同时记录更大范围内足够多样品的运动信息。使得对于布朗运动的分析更具有统计学意义。

推荐相机
  ORCA-Flash4.0 V2 ImagEM X2  
-10°/-30°深制冷且>70%QEsCMOS   业界帧速最高(70fps @ 512x512)的背照式EMCCD

相机
成像和图像分析用高性能相机。多种产品,提供不同的光谱灵敏度、空间分辨率以及读出速度,以满足客户多种领域的各种需求。